- 현재 mRNA 제조는 현재 T7-RNA 합성효소 (T7RNAP)를 이용한 세포외 전사 (in vitro transcription, IVT) 방법이 대부분 사용되고 있습니다. mRNA가 세포내에서 효율적인 단백질 발현을 위해서는 5‘-Cap/5’-UTR/ORF gene/3’-UTR/poly-A tail구조를 지녀야 합니다. ㈜알엔에이팜은 T7 promotor(T7P)/5’-UTR/ORF insertion site/3’-UTR/poly-A tail를 지닌 고유의 mRNA 제조용 벡터를 제작하였으며, 지속적으로 벡터 개량 연구를 진행하고 있습니다.
![세포내에서 단백질 번역을 위한 mRNA 구조](images/ex01.png)
![In vitro transcription용 mRNA 제작을 위한 ㈜알엔에이팜 mRNA 제조용 벡터 DNA](images/ex02.png)
- 벡터에 원하는 ORF 유전자는 overlapping PCR에 의해 삽입하는 방법을 사용하며, 제한효소 절단으로 선형 DNA로 만들 수 있습니다, 다음 T7 promotor (T7P)를 인식하는 T7 RNA polymerase (T7RNAP)를 이용하여 in vitro transcription (IVT)에 의해 mRNA를 효소합성 할 수 있습니다.
- mRNA의 5‘-capping 및 2’-O 메틸화는 세포내에서 전사후 수식(post-transcriptional modification)에 의해 일어나는데, 숙주 세포는 이들 수식이 않된 외부 감염된 RNA를 인지하여 제거할 수 있으며, 수식이 않된 mRNA는 단백질로 번역 (translation)이 일어나지 않습니다. In vitro mRNA capping은 mRNA IVT후 효소 (vaccinia capping 효소 및 2‘-O-methylase)를 이용한 전사후 수식법을 사용하였으나, 최근 T사가 개발한 Cap1-dinucleotide를 이용하면 IVT시 Cap1-mRNA 제조의 가능합니다.
- 본사는 T사의 Cap1-dinucleotide과 차별화된 IVT용 Cap을 개발할 예정입니다.
![참고자료](images/ex03.jpg)
![참고자료](images/ex04.png)
- ㈜알엔에이팜은 모기업인 ㈜바이오니아가 판매하는 T7RNAP, NTP 및 T사 Cap1-dinucleotide등 기질들을 이용하여, 반응용액 최적화를 통하여 60% 이상의 기질 NTP가 mRNA에 포함되고, mRNA에 Cap1이 90% 이상 포함되도록 mRNA IVT에 최적화된 키트를 개발하였고 계속 개량중에 있습니다.
- 특히 본사키트 사용시 현재 많이 사용되는 N사 키트에 비해 2차 구조 생성이 적게 나타났습니다. 본사 키트로 제조한 Cap1-mRNA는 세포내에서 매우 높게 단백질을 발현하였습니다.