- 현재 mRNA 제조는 현재 T7-RNA 합성효소 (T7RNAP)를 이용한 세포외 전사 (in vitro transcription, IVT) 방법이 대부분 사용되고 있습니다. mRNA가 세포내에서 효율적인 단백질 발현을 위해서는 5‘-Cap/5’-UTR/ORF gene/3’-UTR/poly-A tail구조를 지녀야 합니다. ㈜알엔에이팜은 T7 promotor(T7P)/5’-UTR/ORF insertion site/3’-UTR/poly-A tail를 지닌 고유의 mRNA 제조용 벡터를 제작하였으며, 지속적으로 벡터 개량 연구를 진행하고 있습니다.
- 벡터에 원하는 ORF 유전자는 overlapping PCR에 의해 삽입하는 방법을 사용하며, 제한효소 절단으로 선형 DNA로 만들 수 있습니다, 다음 T7 promotor (T7P)를 인식하는 T7 RNA polymerase (T7RNAP)를 이용하여 in vitro transcription (IVT)에 의해 mRNA를 효소합성 할 수 있습니다.
- mRNA의 5‘-capping 및 2’-O 메틸화는 세포내에서 전사후 수식(post-transcriptional modification)에 의해 일어나는데, 숙주 세포는 이들 수식이 않된 외부 감염된 RNA를 인지하여 제거할 수 있으며, 수식이 않된 mRNA는 단백질로 번역 (translation)이 일어나지 않습니다. In vitro mRNA capping은 mRNA IVT후 효소 (vaccinia capping 효소 및 2‘-O-methylase)를 이용한 전사후 수식법을 사용하였으나, 최근 T사가 개발한 Cap1-dinucleotide를 이용하면 IVT시 Cap1-mRNA 제조의 가능합니다.
- 본사는 T사의 Cap1-dinucleotide과 차별화된 IVT용 Cap을 개발할 예정입니다.
